A series of agri-food by-products, both crop pruning as agroindustry residues, with proven biocide activity compounds have been selected and gathered.
The objective is the development of a residual biomass supply plan for the manufacturing of extracts that will take part in the composition of new pesticide formulates, replacing the chemical origin ones used a t present.
ICA-CSIC and CTAEX working teams have selected and gathered three kinds of agri-food by-products as source of biocide compounds:
a)    Plant solid residues from the steam distillation of aromatic species: wormwood, winter savory, dittrichia, groso lavender, red thyme, oregano and olivardilla.
b)    Vegetable processing residues: blanched artichokes and asparagus, and their blanching water, and alperujo (olive oil mill waste water).
c)    Pruning from different crops:  lemon, orange and grapefruit, olive tree, eucalyptus and fine chips from eucalyptus, holm oak and black poplar pruning 
Generation periods, their conditions and volumes produced have also been recorded, in order to assure suppliers for pilot extractions from theses residual biomass. The corresponding deliverable compiles all the information.

The following eight agricultural by-products are available

1.    Artichoke peels
2.    Water from artichoke blanching
3.    Asparagus peels
4.    Water from asparagus blanching
5.    AJENJO var. Candial (extracted wormwood)
6.    AJEDREA: Satureja montana parental line (extracted winter savory)
7.    SAMO: S. montana var. Martín (extracted winter savory var. Martin)
8.    Dittrichia graveolens (extracted stinkwort)

The fresh artichoke and asparagus vegetable and water residues of from the canning processes were frozen and lyophilized. All plant materials were dried in a stove with circulating air at 35ºC. Once dried, we can proceed to mill it and subsequent extraction.

Extraction: depending on the starting material, a solid-liquid (Sohxlet type) or liquid-liquid extraction is carried out, following the established protocols in this action.
 

An extraction protocol has been developed in order to obtain micro-extract from the agroindustry by-products with potential bio pesticide capacity collected. Due to the different agri-food by-products’ physical nature, two different extraction protocols have been defined:
-    Solid- liquid Soxhlet extraction, for solid residues and for those liquid ones that required previous lyophilization, such as blanching waters, using Ethanol as extracting agent.
-    Liquid- liquid extraction, with Ethanol also, for liquid by-products.

The objective is the obtaining of by-products´ micro-extracts that will be assessed on their biocide capacity over organisms causing pests and diseases of stone fruits.
ICA-CSIC and CTAEX working teams have carried out the extractions and assessed their yield regarding their industrial scale-up.

Insecticidal, nematicide, bactericidal and fungicidal activities of micro-extracts from agri-food by-products have been assessed at ICA-CSIC and CTAEX laboratories according to standardized analytical protocols. These assays include antifeedant activity to phytophagous insects, tests with phytophagous nematodes, fungistatic and bactericidal capacity.
The by-products´ micro-extracts with higher bio pesticidal activity have been selected and will be tested in binary mixes for the strengthen of their synergic activity.
All this information is compiled in the corresponding deliverable: Report on extracts´ validation.

Se ha concluido la tarea de planificación, búsqueda y obtención de materias primas para diseñar formulados innovadores. Para esta selección de materias primas, se ha tenido en cuenta bibliografía científica, sus propiedades fisicoquímicas y la capacidad coadyuvante y potenciadora. También ha sido muy importante escoger sustancias que cumplan con el reglamento ecológico y así conseguir formulados sostenibles con el medio ambiente. La fotografía muestra los resultados de 4 matrices de formulación candidatas a formar parte de los nuevos formulados finales.

Cumpliendo con el protocolo interno de diseño de formulación establecido por IDAI Nature, se han llevado a cabo entre 15-20 prototipos de formulación por cada extracto vegetal suministrado. Cada prototipo de ser estable en tiempo a temperaturas extremas de almacenamiento, no debe contener precipitados y debe ser miscible en agua para permitir su aplicación en campo. Solo los prototipos que han cumplido con estas condiciones pasarán a la fase de optimización industrial.

El principal objetivo de la acción B3 en su conjunto es demostrar que los productos bioplaguicidas resultantes del proyecto Waste4Green, tienen una baja o moderada toxicidad, tanto para el ser humano como para los indicadores del medio ambiente acuático y terrestre, y que su uso puede ser más seguro que los productos químicos comercializados.

La puesta en el mercado de un producto fitosanitario requiere de un proceso complejo enmarcado en la normativa europea vigente.

Dentro de los diferentes pasos a seguir, la evaluación toxicológica es un punto crítico, ya que las pruebas experimentales de toxicidad (por ejemplo, estudios de largo plazo, cáncer y reproducción) tienen un coste elevado asociado, requieren mucho tiempo de ejecución (más de dos años) y emplean un gran número de animales de laboratorio.

Por ello, en el caso del proyecto Waste4Green, estamos abordando el estudio toxicológico con la ayuda de las técnicas In silico, más específicamente mediante la simulación con los modelos cuantitativos de relación estructura-actividad (QSARs), que son capaces de predecir la toxicidad química sin datos experimentales, siguiendo el principio de 3R (Reemplazar, Reducir, Refinar el uso de animales de laboratorio).

Se ha iniciado la búsqueda de bibliografía disponible de los productos fitosanitarios ya comercializados, estableciendo rangos de toxicidad para la posterior elaboración de las tablas comparativas con los resultados obtenidos para los nuevos bioplaguicidas de Waste4Green.

Se ha evaluado la ecotoxicidad en medio acuático y terrestre, de los coformulantes potenciales para la elaboración de los formulados del proyecto Waste4Green, con el objetivo de conocer cuál será el efecto que se origina en el medio ambiente tras la exposición a estos productos. 

Los métodos utilizados por el ISCIII dentro del proyecto Waste4Green, siguen las Líneas Directrices de la OCDE para el control de productos químicos y de la Agencia Internacional de Estandarización (ISO) para la calidad del agua. Los marcadores de exposición y de efecto son indicadores biológicos tanto del medio acuático (Daphnia magna) como del medio terrestre, lombriz de tierra (Eisenia foetida).

De izq. a dcha.: Daphnia magna straus adulta; Daphnia magna straus Ensayo toxicidad aguda; Eisenia foetida adulta Periodo de 3 horas para vaciamiento intestinal; Ensayo de toxicidad aguda sobre papel de filtro en la lombriz de tierra Eisenia foetida

En la actualidad el Instituto de Salud Carlos III, en sus laboratorios de Toxicología Ambiental del CNSA,  está realizando el estudio toxicológico de los tres formulados que se han desarrollado en el proyecto, con el fin de evaluar su comportamiento sobre la salud y el medioambiente acuático y terrestre. Para ello se valora el efecto ecotoxicológico sobre indicadores biológicos representativos de una cadena trófica dulce-acuícola y del medio telúrico.

Se ha iniciado la búsqueda de bibliografía disponible de los productos fitosanitarios ya comercializados, estableciendo rangos de ecotoxicidad para la posterior elaboración de las tablas comparativas con los resultados obtenidos para los nuevos bioplaguicidas de Waste4Green.

The trials have been designed with the objective of demonstrating under real field conditions that the products developed in the previous actions have activity and can be used in the field to prevent pest and disease attacks on stone fruit trees. 

The formulations developed with eucalyptus extract, with alpeorujo extract and the synergic one (with eucalyptus and dittrichia) at different doses, are compared with the conventional and organic treatment with active ingredients registered for Organic Agriculture.

In each of the theses, different parameters are evaluated:
phenology, incidence of pests and diseases, nutritional status, residues in soils, and residues in leachate water. In addition, representative samples have been harvested and separated by ripening stage and size, which will allow us to evaluate the yield and health of the fruit. Fruit quality will also be evaluated and shelf-life tests will be conducted.

Until October 2019, a replicability and transferability Plan have been developed with the aim of laying the foundations for transferring the results of the project to other European crops and regions.
Among the actions to be carried out are the transfer of project results to the actors involved in replicability, the validation of Waste4Green products on farms in other EU countries and on other crops, or the identification of new strategic partners to extend replicability within the EU.
The corresponding deliverable has been issued.

¿Qué impactos ambientales tiene la producción, distribución y aplicación de los nuevos formulados? ¿En qué aspectos mejora con respecto a los formulados convencionales? A preguntas como éstas se dará respuesta mediante el Análisis del Ciclo de Vida. Durante el año 2020, se está trabajando en el ciclo de los productos convencionales, de forma que se puedan identificar los principales impactos y compararlos con los nuevos productos desarrollados en el LIFE Waste4Green. 

¿Cómo se comporta una explotación convencional de fruta de hueso tipo en relación a emisión de gases de efecto invernadero, consumo energético, secuestro de carbono o desempeño para con la biodiversidad? ¿Cómo mejoran o empeoran estos aspectos cuando se sustituyen algunos de los formulados convencionales para el control de plagas por los nuevos formulados desarrollados en el LIFE Waste4Green? Con la ayuda de dos herramientas innovadoras como la ACCTool y la Biodiversity Performance Tool, desde el proyecto podremos realizar la comparativa y exponer en 2022 estos resultados.

On Septembre 2019, the protocol for monitoring agricultural biodiversity has been defined, with the methodology that will be used during the project, and the corresponding deliverable has been issued.
During the first year of monitoring, the arthropod populations in the demonstration plots have been evaluated in order to establish in later years the effect of the application of the new formulations in comparison with conventional products. Data are compiled in the corresponding deliverable.

On February 2019, the protocol for Socio-economic monitoring of the project actions has been defined, with the methodology that will be used during the project, and the corresponding deliverable has been issued.
The Socioeconomic Monitoring Protocol is meant to lay the foundations for assessing the short and mid-term sustainability of the new formulations beyond the project lifetime, as well as estimating an actionplan for them in a larger scale.